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  摘要 HBF工藝（hybridbiological&fixedfilmtechnology）是廢水處理的一種有效方法，且填料是該工藝的核心。然而，典型填料對(duì)污水處理性能的影響及其機(jī)制并不清楚。為此，采用軟性填料（RT）、彈性填料（TT）、組合填料（ZT）、酶浮填料（MT）、聚酯填料（JT）和滌綸填料（DT）6種填料構(gòu)建HBF反應(yīng)器處理生活污水。結(jié)果表明，測(cè)試期內(nèi)COD平均去除率差異不顯著（P＞0.05），而氨氮的平均去除率差異顯著（P＜0.05），且MT反應(yīng)器的COD及氨氮平均去除率均最高。為揭示其差異形成原因，比較了不同反應(yīng)器內(nèi)生物膜干重、微生物活性、微生物群落組成及硝化細(xì)菌功能基因（amoA、NSR）的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物膜干重差異顯著（P＜0.05）且微生物活性差異顯著(P＜0.05)，生物膜上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同但優(yōu)勢(shì)菌群均為變形桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)及厚壁菌門(mén)等，MT中amoA、NSR拷貝數(shù)均顯著高于其他5種填料（P＜0.05）。因此，HBF工藝不同填料污水處理性能的差異主要是由生物膜的生物量及功能微生物組成兩方面導(dǎo)致。

  本試驗(yàn)所用的填料包括酶浮填料（MT）、聚酯填料（JT）、滌綸填料（DT）、軟性填料（RT）、彈性填料（TT）和組合填料（ZT）。采用人工裁剪方式，將前3種填料剪成條狀（2cm×15cm），固定在ZT配套的骨架上，且底端固定填料以保證其在反應(yīng)池中相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。6種填料性質(zhì)及掃描電子顯微鏡（SEM）圖分別如表1、圖1所示。

1.2試驗(yàn)裝置及運(yùn)行工況


  采用有機(jī)玻璃反應(yīng)器（圖2）實(shí)施廢水處理。反應(yīng)器有效體積為6L，其污泥濃度（MLSS）為3000mg/L，DO為5mg/L，污泥回流比100%。反應(yīng)器采用連續(xù)進(jìn)出水，HRT設(shè)置為4~12h（表2）。人工配置的污水pH值為7.0，COD濃度為250mg/L，TN濃度為50~90mg/L，TP濃度為3mg/L及部分微量元素。

1.3水質(zhì)指標(biāo)與分析方法


  測(cè)定的水質(zhì)指標(biāo)有COD、氨氮（NH4+-N）及TN。采用高錳酸鹽酸性法（GB11914—89）測(cè)定CODMn；采用納氏試劑分光光度法（GB7481—87）測(cè)定NH4+-N；采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB—11894—89）測(cè)定TN。


1.4生物膜量及微生物活性測(cè)定方法


  采用干重法定量評(píng)價(jià)生物膜負(fù)載量[5]。將含有生物膜的溶液用0.45μm濾膜（使用前稱(chēng)重）過(guò)濾，把濾膜置于溫控105℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，干燥至恒重，過(guò)濾前后的質(zhì)量差即為生物膜干重。結(jié)果取各反應(yīng)器運(yùn)行第20、30、45、60d及80d所測(cè)結(jié)果的平均值。采用TTC-還原法[10]對(duì)脫氫酶活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果取各反應(yīng)器運(yùn)行第20、30、45、60d及80d所測(cè)結(jié)果的平均值。


1.5微生物分析


1.5.1DNA提取及PCR擴(kuò)增


  從每個(gè)反應(yīng)器取適量的生物膜樣本，用PowerSoilDNA提取盒（QbiogeneInc.,Carlsbad,CA,USA）按照DNA提取盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)提取DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。PCR采用TransGenAP221-02:TransStartFastpfuDNAPolymerase。擴(kuò)增采用的細(xì)菌16SrRNA引物序列為:338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'[11]；AOB引物序列為:amoA-1F:5'GGGGTTTCTACTGGTGGT-3',amoA-2R:5'CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3'[12]；NOB引物序列為:NSR1113R:5'-CCTGCTTTCAGTTGCTACCG-3'，NSR1264R:5'-GTTTGCAGCGCTTTGTACCG-3'[13]。


  采用50μL反應(yīng)體系：10~100ng模板，25μL的2×TaqPCRMasterMix，1μL的25μmol/L引物，后用超純水補(bǔ)至50μL。


  PCR反應(yīng)步驟：95℃下預(yù)變性10min；95℃下變性15s，60℃退火60s，共40個(gè)循環(huán)。全部樣本按照正式試驗(yàn)條件進(jìn)行，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5.2Miseq文庫(kù)構(gòu)建和Miseq測(cè)序


利用NEBNextDNA文庫(kù)制備試劑盒（NewEnglandBiolabs公司，USA）在PCR產(chǎn)物兩端加上短接頭，構(gòu)建出DNA文庫(kù)。經(jīng)MiSeqreagentkitV2試劑盒（Illumina公司，USA）處理后，委托美吉生物采用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。


1.5.3功能基因的熒光定量


  使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-timeqPCR）中SYBRGreen方法對(duì)AOB的amoA及NOB的NSR基因進(jìn)行定量分析。試驗(yàn)中設(shè)置陰性對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，同時(shí)以梯度稀釋的質(zhì)粒DNA和樣品DNA進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。AOB及NOB定量所用引物參見(jiàn)上述普通PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系均為20μL：SYBRGreenPremixEXTaq酶（Takara，大連）10μL，濃度為10pmol/LAOB及NOB正反向引物各0.8μL，DNA模板1μL，用超純水補(bǔ)足至20μL。采用IQ5Thermocyler擴(kuò)增儀（RG65HD，Corbett，Australia）進(jìn)行定量PCR。定量PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，53℃退火60s，72℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸10min。


2結(jié)果與討論


2.1填料對(duì)HBF反應(yīng)器的污水處理效率的影響


  按試驗(yàn)方法，開(kāi)展了填料對(duì)HBF反應(yīng)器污水處理效率的影響試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。由圖3(A)可知，不同填料反應(yīng)器的CODMn去除效率均大致呈“升高-下降-平穩(wěn)”的趨勢(shì)，以MT反應(yīng)器為例，在第7~19d，CODMn去除率從75.65%提高到97.32%；隨著HRT的下降（從12h到8h，第21~35d），CODMn去除率先小幅下降后回升，該階段平均去除率達(dá)95.40%；隨著HRT的持續(xù)降低（從8h到4h，第36~50d），CODMn去除率從最高98.58%下降到最低77.76%，后逐漸回升至80%以上，該階段測(cè)試期間平均去除率為87.16%。當(dāng)HRT維持在4h時(shí)，即使進(jìn)水NH4+-N濃度提高（從50mg/L到70mg/L（51~65d）再到90m/L（65~80d）），對(duì)CODMn去除率的影響較小，兩個(gè)階段測(cè)試期間CODMn的平均去除率分別為90.07%、88.44%。


  HRT減少導(dǎo)致CODMn去除率下降的主要原因可能是水力負(fù)荷加大，一方面造成反應(yīng)器的有機(jī)負(fù)荷增加，另一方面過(guò)大的水力負(fù)荷對(duì)填料表面的生物膜產(chǎn)生了沖擊[14]。反應(yīng)器成熟后，即使進(jìn)水NH4+-N濃度加大，CODMn去除率比較穩(wěn)定，可能原因是好氧反應(yīng)器內(nèi)異養(yǎng)菌活性較大，受進(jìn)水NH4+-N濃度影響不是很大[15]。


  總體來(lái)看，測(cè)試期間各填料反應(yīng)器CODMn平均去除效率介于79.35%~91.72%，其排序?yàn)镸T＞JT＞ZT＞DT＞RT＞TT；填料對(duì)CODMn的去除影響差異并不顯著（P＞0.05）。

  由圖3(B)可知，不同填料反應(yīng)器的氨氮去除效率變化規(guī)律整體呈上升的趨勢(shì)，中間有波動(dòng)，整體平穩(wěn)，后期去除率有所下降。以MT反應(yīng)器為例，從第7~22d的NH4+-N去除率呈上升趨勢(shì)，最高達(dá)96.27%。隨著HRT的持續(xù)降低（從8h到4h，第36~50d），NH4+-N去除率有所下降，該階段測(cè)試期間NH4+-N平均去除率為92.65%。當(dāng)HRT維持在4h時(shí)，進(jìn)水NH4+-N濃度從50mg/L提高到70mg/L，再到90mg/L，反應(yīng)器對(duì)NH4+-N去除率影響不大，兩個(gè)階段測(cè)試期NH4+-N平均去除率為90.25%、89.57%。


  HRT減少導(dǎo)致NH4+-N去除率下降的主要原因可能是系統(tǒng)水力負(fù)荷加大，硝化菌沒(méi)有足夠的時(shí)間完成對(duì)NH4+-N的降解，使各反應(yīng)器NH4+-N去除率存在波動(dòng)。Liu等[16]研究表明，當(dāng)NH4+-N負(fù)荷一定時(shí)，HRT的減小將造成NH4+-N轉(zhuǎn)化效率下降。第四、第五階段，HRT維持4h而NH4+-N濃度升高，導(dǎo)致NH4+-N去除率也有所降低，但變化并不明顯，其主要原因可能是進(jìn)水C/N比降低，有機(jī)碳源量要求較高的異養(yǎng)細(xì)菌部分被淘汰，降低了種群的多樣性。據(jù)報(bào)道[17]稱(chēng)當(dāng)進(jìn)水C/N比減小時(shí)，自養(yǎng)菌會(huì)代替異養(yǎng)菌在生物膜外層生長(zhǎng)繁殖。總體來(lái)看，測(cè)試期間各填料反應(yīng)器的NH4+-N平均去除效率約67.12%~88.12%，其排序?yàn)镸T＞JT＞ZT＞DT＞RT＞TT；填料對(duì)NH4+-N的去除影響差異顯著（P＜0.05）。


綜上可知，在不同工況下應(yīng)用HBF工藝處理不同負(fù)荷的生活污水時(shí)，不同填料反應(yīng)器對(duì)CODMn去除效率差異較�。≒＞0.05），而NH4+-N去除效率差異顯著（P＜0.05）。


2.2生物膜量及微生物活性分析


生物膜的形成與生長(zhǎng)是實(shí)現(xiàn)污水處理的前提，生物膜量及活性是評(píng)價(jià)生物膜質(zhì)量的重要依據(jù)[18-19]。在廢水生物處理中，生物膜脫氫酶活性可反映處理體系中活性微生物量及其對(duì)有機(jī)物的降解活性，因而成為評(píng)價(jià)生物膜活性的指標(biāo)[20]。因此，為揭示不同填料反應(yīng)器的去除效率差異較大的原因，按試驗(yàn)方法測(cè)定了生物膜量及單位質(zhì)量生物膜的脫氫酶活性，結(jié)果如圖4所示。

  由圖4(A)可知，不同填料的生物膜負(fù)載量及脫氫酶活性均差異顯著（P＜0.05）。MT負(fù)載的生物膜量最大，其干質(zhì)量達(dá)8.11g，而RT負(fù)載的生物膜量最小，其干質(zhì)量為6.07g；該指標(biāo)大小順序?yàn)椋篗T＞DT＞JT＞ZT＞TT＞RT。圖4中脫氫酶的活性結(jié)果表明：活性最高的是JT（208.55μgTF/(g生物膜•h)），活性最低的是RT（180.43μgTF/(g生物膜•h)）；填料的生物膜活性大小順序?yàn)椋篔T＞MT＞ZT＞TT＞DT＞RT。由于不同反應(yīng)器的NH4+-N的去除效率差異顯著而對(duì)CODMn的去除效率差異較小，為定量評(píng)價(jià)兩指標(biāo)對(duì)污水處理性能的影響差異，分析NH4+-N去除率與生物膜量及單位質(zhì)量生物膜的脫氫酶活性的相關(guān)性，結(jié)果如圖4(B)、圖4(C)所示。


由圖4可知，NH4+-N去除率受生物膜量及單位質(zhì)量生物膜的脫氫酶活性影響顯著，其相關(guān)系數(shù)均大于0.50，微生物組成決定了微生物脫氫酶活性。為此，本研究進(jìn)一步分析了生物膜中的微生物群落結(jié)構(gòu)。


2.3生物膜中微生物群落結(jié)構(gòu)分析


  按試驗(yàn)方法分析了生物膜的微生物群落。由樣本的層級(jí)聚類(lèi)分析（圖5(A)）可知，六個(gè)樣品中的微生物群落可以分為三個(gè)不同的類(lèi)群：第一類(lèi)包括樣本S3、S5及S6；第二類(lèi)為樣本S2；第三類(lèi)包括樣本S1及S4。層級(jí)聚類(lèi)分析結(jié)果與對(duì)生物膜樣本的PCoA主坐標(biāo)分析（圖5(B)）結(jié)果一致。主坐標(biāo)分析（Principalcoordinatesanalysis，PCoA），可用來(lái)研究微生物群落組成的相似性或差異性。由圖5(B)可知，樣本S3、S5及S6聚集在一起，S1與S4聚集在一起，且均與S2相距較遠(yuǎn)。以上結(jié)果說(shuō)明不同填料上微生物組成存在差異。

  為進(jìn)一步揭示其群落結(jié)構(gòu)差異，基于細(xì)菌菌門(mén)水平（圖6）、變形菌門(mén)（表3）及菌屬水平（圖7）分析生物膜上的微生物群落結(jié)構(gòu)組成。由圖6可知，從菌門(mén)水平來(lái)看，不同填料反應(yīng)器中微生物群落組成的差異不是特別大。6種填料生物膜樣本的主要菌群均為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）及放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）。以MT反應(yīng)器為例，其生物膜樣本變形菌門(mén)占比達(dá)56.2%，其次是擬桿菌門(mén)（25.3%）、厚壁菌門(mén)（14.8%）。其他5種填料生物膜樣本上的變形菌門(mén)占比介于28%~54.3%，擬桿菌門(mén)占比介于23.5%~57.3%，厚壁菌門(mén)介于9.2%~16.1%。該結(jié)果與前人研究結(jié)果相近，如Ma等[21]在序批式反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌群落組成中變形菌門(mén)（占比最大）、擬桿菌門(mén)及放線(xiàn)菌門(mén)占優(yōu)勢(shì)；Snaidr等[22]在常規(guī)活性污泥中對(duì)菌群多樣性的研究中發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。在6個(gè)樣品中還有綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、浮酶菌門(mén)（Planctomycetes）、綠菌門(mén)（Chlorobi）及單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）等，但所占比例均不同。其中綠菌門(mén)在顆粒化過(guò)程中有重要作用，能夠增強(qiáng)污泥的沉降性能。

  如表3、圖7所示，從變形菌門(mén)微生物的分布、細(xì)菌菌屬水平分析可看出填料的差異對(duì)微生物群落組成形成了顯著差異。由圖6可知，各填料生物膜樣本中變形菌門(mén)的占比較大。變形菌門(mén)又分為五類(lèi)，分別為α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱和ε-變形菌綱。國(guó)內(nèi)外研究[23]發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)在生物脫氮、生物除磷及諸多污染物降解過(guò)程中起重要作用的微生物均歸屬于變形菌門(mén)，其中β-變形菌綱包括某些AOB（包括亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）和亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira等））在內(nèi)等很多好氧或兼性菌，且AOB是其主要成員[24-25]；γ-變形菌綱則包括腸桿菌科(Enterobacteraceae)和假單胞菌科（Pseudomonadaceae）等；δ-變形菌綱包括脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、脫硫菌屬（Desulfobacter）及NOB類(lèi)的硝化刺菌屬（Nitrospina）等菌屬。

  綜合以上對(duì)生物膜上微生物的群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可知，不同填料反應(yīng)器中的微生物組成還是存在較大差異的。其中MT反應(yīng)器生物膜樣本變形菌門(mén)占比最多。結(jié)合圖3(B)各反應(yīng)器對(duì)氨氮的去除率，MT生物膜相比于其他5種填料生物膜可能存在相對(duì)較多的硝化菌，且包括大部分脫氮菌的變形菌門(mén)也占比最多（56.2%）。這可能就導(dǎo)致MT反應(yīng)器的污水去除效果較好。為進(jìn)一步確定各反應(yīng)器生物膜樣本中硝化菌數(shù)量差異，本試驗(yàn)對(duì)生物膜樣本上的硝化菌進(jìn)行了功能基因（amoA、NSR）熒光定量PCR分析。


2.4生物膜硝化功能基因（amoA、NSR）熒光定量分析